重磅出击
非侵入式肺结节良恶性辅助诊断新技术
继在ClinicalCancerResearch《临床肿瘤研究》杂志发表循环染色体异常细胞（geneticallyabnormalcirculatingcells,CAC）检测技术用于非小细胞肺癌诊断之后[1]，近日，美国安德森癌症中心（MDAndersonCancerCenter）前细胞病理学科室主任、细胞图像诊断实验室主任，著名病理学专家RuthL.Katz教授在美国癌症协会（AmericanCancerSociety）官方期刊CancerCytopathology《癌症细胞病理学》，进一步揭示了CAC在肺部良、恶性结节患者外周血液中的分布差异，探索了基于4色荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）的CAC检测应用于肺癌早诊、肺癌风险分层与诊疗决策的潜在价值[2]。
研究背景
1.肺癌是世界范围发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[3]。在中国，每年有超78万的肺癌新发患者，每5个恶性肿瘤死亡患者中就有一个是肺癌患者，发病率和死亡率在所有癌种中均位列第一[4]。
2.早诊早治是提高肺癌患者存活率的关键[5]。I期肺癌患者在发现结节后一个月内接受手术切除和治疗，其10年存活率可高达92%[6]。因为缺乏有效的早筛早诊方法，只有10-15%的肺癌患者在早期被发现[3]。
3.美国国家肺癌筛查试验（NLST）结果显示，与X线胸片相比，低剂量螺旋CT（LDCT）可降低20%肺癌死亡率[7]。LDCT被广泛推荐于高危人群肺癌筛查，但该研究同时发现LDCT假阳性率高达96.4%，临床为明确LDCT筛查出的肺结节性质，穿刺活检手术等有创性诊疗明显增加，而穿刺活检肺结节中有1/3左右为良性[8]。同时，穿刺手术可能对患者造成心理负担以及气胸、出血等创伤[9]，使临床急需一种简便、安全、有效、无创的肺结节良恶性辅助诊断工具。
4.研究发现循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells,CTC）可以比LDCT早1-4年发现恶性肿瘤[10]。但早期癌症患者外周血中的CTC含量稀少，目前CTC检测主要依靠细胞表面抗体（EpCAM等细胞表面蛋白）[11]。但大部分的血液中CTC都经历了上皮质间转换，从而失去了EpCAM表达，导致检测困难[11,12]。
5.如果要将CTC用于肺癌早期诊断，必须突破其对上皮细胞标记物（EpCAM等）的依赖，同时将CTC与血液中白细胞区分开来[13]。RuthL.Katz教授在肺鳞状细胞癌和腺癌中发现了多个共同缺失或扩增的基因，并在年ClinicalCancerResearch杂志发表了利用FISH技术观测到3号染色体的3p22.1/3q29位点与10号染色体的10q22.3/CEP10位点在非小细胞癌患者基因组中变化的情况，开发了一种不依赖表面抗体检测非小细胞肺癌相关CTC的技术。她指出该技术可以成为肺癌辅助诊断工具，提高肺结节良恶性判断的准确率[1]，并将这种新发现的CTC命名为循环染色体异常细胞（CAC）。
研究设计
本研究旨在评估经LDCT检出肺结节的患者外周血循环肿瘤细胞的分布特征和辅助诊断价值。
研究实验组（n=）中肺癌入组者均来自安德森癌症中心，并满足以下条件：
1）近期无其他脏器癌症史；
2）经过针芯穿刺活检、细针抽吸活检、手术切除等确诊肺癌患者。
研究对照组（n=）由以下三部分组成：
1）来自某肺癌分子流行病学研究的26例受试者；
2）根据年龄、吸烟、癌症家族史划分为肺癌高危人群，并担心自己罹患肺癌(无癌症史)的受试者54例；
3）LDCT检测大于6毫米结节，穿刺活检病理学结果是良性结节的患者20例。
从年11月至年3月收集到的例定义为开发集，随后本研究又收集到89例定义为测试集。
图1实验流程：
A）对无法确认良恶性的肺结节患者的血液进行Ficoll密度分离处理；
B）将外周血中的单个核细胞放置于玻璃载玻片上，并使用定制的4色荧光原位杂交法进行检测；
C）结果与针芯穿刺活检、细针抽吸活检、以及手术切除的组织结果进行比较。
图2典型阳性病例，显示LDCT扫描图像及对应FISH检测的结果：
A）一例55岁非吸烟女性患者的LDCT结果，发现多个未钙化的结节并疑似为真菌类疾病和恶性肿瘤；(B-G)在活检之前，通过FISH检测出8个CAC，图中显示了其中2个CAC的单独及融合荧光图像；
B）带有4?,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)染色的细胞核图像（原始放大倍数为倍）。
C）CAC的合并图像显示3p22.1（红色）和10q22.3（金色）两个位点同时发生了扩增现象，CEP10（蓝色）和3q29（绿色）仍然为二倍体；染色体异常检测使用了4色FISH探针和BioViewDuet-3显微镜系统（原始放大倍数倍）；
D）三个红色信号与3p22.1拷贝数一致（箭头处）；
E）三个金色信号与3个10q22.3拷贝数一致（箭头处）；
F）两个蓝色信号代表2个CEP10拷贝（箭头处）；
G）两个绿色信号代表2个3q29拷贝（箭头处）。
研究结果
图3受试者的详细统计资料
表1循环肿瘤细胞在肺结节良恶性鉴别的辅助诊断效果
_开发集
测试集
受试者整体
灵敏度
95.1%
80%
88.8%
特异性
%
%
%
准确性
97.5%
89.9%
94.2%
AUC
0.
0.
0.
图4≥3个CAC作肺结节良恶性评估分层标准并与病理结果进行对比所得出的ROC曲线下方的面积大小（AUC）：
A）开发集；B）测试集；C）受试者整体。
例完成病理检测的肺癌受试者中，61%为腺癌，19%为鳞状细胞癌，其余的癌种占21%。早期肺癌患者占总数61%，I期患者55例，II期患者10例（图3）。
与病理结果对比分析后，CAC在肺结节良恶性的诊断效能非常理想，灵敏度在开发集和测试集中分别为95.1%和80%，特异性均为%，整体准确率为94.2%（表1）。开发集、测试集以及受试者整体的ROC曲线下方的面积大小（AUC）分别为0.、0.和0.（图4）。
临床意义
本研究展示了一种简便、安全、有效、无创的检测手段，通过发现外周血细胞基因组中染色体异常，用于肺部结节良恶性辅助诊断。在例确诊肺癌受试者中，61%（65例）为早期肺癌，验证了此技术能有效鉴别早期肺癌与良性结节。该技术还可以与肺癌风险评估工具（梅奥预测模型等）一起，更准确地评估肺结节良恶性风险程度，避免过度有创性诊疗。
这种新型液态活检技术，RuthL.Katz教授在肺部组织[14]、痰液[15]和血液[16]样本中进行了研发与验证，此技术相较与基于抗体-抗原反应捕获CTC，优势在于不受CTC细胞表面抗原表达的限制，减少了肿瘤细胞上皮-间质转化的影响，对于缺乏细胞角蛋白表达的肿瘤细胞也可以进行检测，增加了外周血中肿瘤相关细胞的检出率。在细胞成像方面，通过BioView自动成像软件，自动分选细胞核大于一般淋巴细胞的染色体异常细胞，也有效提高了细胞捕获与鉴别效率。
如Ruth教授在文中提到，通过无创技术实现精准肺癌早期诊断，能为临床诊疗提供最有价值的技术支持[2]。斯坦福大学医学院资深病理学家AlariceCheng-YiLowe教授发表专题评论文章指出[17]，基于FISH的CTC检测方法可以作为传统组织病理检测的补充，还能用于其他非血液类样本分析，在无创技术和简单取样背景下探索新的精准诊断方式，是一个充满希望的细胞病理学研究领域。
参考文献
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[1]KATZRL,HEW,KHANNAA等.Geneticallyabnormalcirculatingcellsinlungcancerpatients:Anantigen-independentfluorescenceinsituhybridization-basedcase-controlstudy[J].ClinicalCancerResearch,.DOI:10./8-.CCR-09-.
[2]KATZRL,ZAIDITM,PUJARAD等.IdentificationofCirculatingTumorCellsUsing4-ColorFluorescenceInSituHybridization?:ValidationofaNoninvasiveAidforRulingOutLungCancerinPatientsWithLow-DoseComputedTomography–DetectedLungNodules[J].:1–10..DOI:10.2/cncy..
[3]HOWLADERN,NOONEAM,KRAPCHOM等.SEERCancerStatisticsReview,-.[R]//NationalCancerInstitute..
[4]CAOM,CHENW.EpidemiologyoflungcancerinChina[Z]().DOI:10./-..
[5]中华医学会呼吸病学分会肺癌学组,中国肺癌防治联盟专家组.肺结节诊治中国专家共识(年版)[Z/OL]().
